鱒魚胚胎提取物：

(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系，在 10°C 條件下飼養(yǎng)，或者受精后 3 天的斑馬魚，在 28°C 條件下飼養(yǎng)），在 -80°C 條件下凍存

(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min

(c)將勻漿通過數(shù)層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )

(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層

(e)將上清液移入 1 只新離心管，按操作步驟（c ) 離心

(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g，60 min )

(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液，然后過濾除菌

(h)提取物過一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾

(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后，在 -80°C 條件下凍存

(j)為了用提取物培養(yǎng)細胞，測量蛋白質濃度（見方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度

(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏，最長 2 個月

BRL 細胞條件培養(yǎng)液：

(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培養(yǎng)液培養(yǎng) BRL 細胞（ATCC )

(b)當細胞匯合時，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養(yǎng)液，在 37°C 條件下培養(yǎng)

(c)5 天后吸出 LDF，過濾，在 -20°C 凍存

(d)向細胞中加入新鮮的 LDF，5 天后重復此過程。條件化的 LDF 培養(yǎng)液可從同一個培養(yǎng)瓶中收集 3 次。然后，將細胞分開培養(yǎng)，使細胞再次匯合

1. 收集約 30 個受精后 8 h 的胚胎。

2. 通過鏈酶蛋白酶處理，除去絨毛膜 [ Sun et al.，1995a ]。

3. 用胰蛋白酶孵育胚胎 1 min，同時用吸管輕輕吹打，以便使細胞分散。

4. 加入 FBS (終濃度為 10 % ) ，終止胰蛋白酶的消化。

5. 離心（500 g ，10 min ) ，收集細胞。

6. 用 5 ml 含有 PGF 的 LDF 原代培養(yǎng)液混懸細胞，然后將細胞移入 25 cm2 培養(yǎng)瓶。

7. 在 26°C 條件下，讓細胞貼壁和匯合。

8. 當細胞匯合時，用同樣的培養(yǎng)液傳代。

9. 培養(yǎng) 2~3 代后，上皮細胞和成纖維細胞將混合出現(xiàn)。這些細胞可用含有 10% FBS 的 LDF 基礎培養(yǎng)液維持培養(yǎng)。通過不同的胰蛋白酶消化，為下一步培養(yǎng)篩選成纖維細胞。

(a)用胰蛋白酶處理細胞 1 min 以除去大部分成纖維細胞，保留貼在瓶壁上的上皮細胞。

(b)將成纖維細胞移入另 1 個培養(yǎng)瓶。當細胞匯合時，重復以上過程。

(c)培養(yǎng) 2~3 代后，細胞均為成纖維細胞。

10. 制備生長抑制的成纖維細胞飼養(yǎng)層：

(a)將細胞加入合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，使成纖維細胞生長成為匯合的單層。

(b)將 10 μg/ml 絲烈霉素 C 加入成纖維細胞中，在 26°C 條件下處理 3 h。

(c)用 LDF 浸洗 3 次后，可將生長抑制的成纖維細胞用作斑馬魚胚細胞培養(yǎng)的伺養(yǎng)層。