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免疫熒光抗體法

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-05　　點(diǎn)擊次數(shù)： 1542次

原理
用人結(jié)腸癌細(xì)胞為免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人結(jié)腸癌細(xì)胞表面抗原（Ag）的單克隆抗體 IgG（第一抗體），二者可以發(fā)生特異性的抗原抗體反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，再加入市售（也可自制）的熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（第二抗體），可以與復(fù)合物進(jìn)一步發(fā)生抗原抗體反應(yīng)（二次抗體反應(yīng)），這樣就可以在光顯微鏡下觀察到這種抗原在結(jié)腸癌細(xì)胞表面的存在。
材料與儀器
HeLa細(xì)胞
1640培養(yǎng)液小牛血清甲醛固定液 PBS 液體石蠟
蓋片載片培養(yǎng)瓶培養(yǎng)皿濾紙鑷子吸管倒置顯微鏡熒光顯微鏡微量加樣器
步驟
1. 將培養(yǎng)瓶中的結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裝有蓋片的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2~3天。

2. 在倒置鏡下觀察到蓋片上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，在蓋片左上角用玻璃筆做一下標(biāo)記，以免在以后的操作中正反面顛倒。

3. 將蓋片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分鐘。

4. 用PBS洗三次，注意不要將PBS液直接倒在蓋片的細(xì)胞面，以免引起細(xì)胞大量丟失。用濾紙片將蓋片上的PBS輕輕吸干，不要損傷細(xì)胞層。

5. 將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上．每個(gè)蓋片50 ul，37℃溫育30分鐘。

6. 用PBS洗三次，濾紙吸干。

7. 將已稀釋好的熒光標(biāo)記羊抗鼠二次抗體5ul滴加在蓋片上，37℃溫育30分鐘。

8. 用PBS洗三次，濾紙吸干。

9. 將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細(xì)胞面朝下放到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。

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